奥地利维也纳兽医大学Iwan Anton Burgener团队在《Journal of visualized experiments》 期刊发表最新研究成果，描述了一种从标准基质包埋的类器官培养物中生成顶端向外肠类器官的方案，并概述了随后将胸苷类似物5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶（EdU）掺入活跃增殖的细胞中以及EdU阳性细胞的半自动定量。
文章介绍
题目：顶端向外肠类器官的生成和EdU标记类器官增殖率的评估 杂志：Journal of visualized experiments 影响因子：1.2 发表时间：2025年3月展开剩余93%#1
研究背景
Background
本文描述了通过水凝胶包埋肠道类器官培养物生成顶端向外肠类器官的漂浮培养物，并建立了用于比较的基底向外肠类器官培养物。
研究中，顶端向外和基底向外肠类器官暴露于EdU，该化合物在细胞分裂的S期会整合到新合成的DNA中。这一过程可以通过激光扫描共聚焦显微镜进行可视化，并利用图像分析软件半自动定量Hoechst33342和EdU标记的细胞，从而计算EdU阳性细胞在总细胞中的比例。
这种方法不仅适用于肠道类器官的增殖分析，还可以用于其他类器官或二维细胞培养物的细胞增殖研究。
#2
研究思路
Methods
建立肠道类器官培养体系 诱导极性反转 EdU标记细胞增殖 比较顶端向外和基底向外类器官 图像分析与数据处理#3
研究设计：
Design
工作流程包括类器官培养、极性反转诱导与EdU标记、Click-it EdU染色反应和Hoechst 33342染色、半自动图像分析、类器官增殖率的测定。
#4
代表性结果
Results
理想的类器官大小应在50-250 μm之间（图1A），过大的类器官可能无法有效地反转极性，并可能开始出芽，影响极性反转。在形态学上，基底向外类器官和顶端向外类器官有明显区别。
基底向外类器官保持较大的腔室（图1B），而顶端向外类器官则更紧凑（图1C），且周围漂浮着死亡细胞，这些死亡细胞是由顶端向外类器官排出到培养基中的。相较之下，基底向外类器官在腔内积累死亡细胞。
图1 极性逆转诱导前后的类器官形态。(A) 胰酶消化后的肠类器官细胞在生长培养基中培养3天后形成的基质包埋态。(B) 悬浮培养3天后形成的基底向外类器官。(C) 在不添加BME基质的悬浮培养体系中培养3天诱导形成的顶膜向外类器官（极性逆转态）。比例尺=200 μm。
在细胞增殖分析方面，使用EdU标记新合成的DNA后，基底向外类器官在时间推移中表现出更高的EdU信号（图2）。然而，并非所有类器官都有EdU+细胞，部分类器官在特定成像层中可能不显示EdU+信号。
图2 EdU标记的基底向外与顶端向外肠类器官。上图显示基底向外类器官随时间变化的共聚焦图像，在相同时间点下，其EdU阳性细胞数量显著多于下图所示的顶端向外类器官。比例尺=100 μm。
通过图像分析软件，类器官首先被圈出（图3A），然后排除不相关的区域（图3B）。接着自动分析流程对细胞核进行分割，区分Hoechst33342+和EdU+细胞核，同时排除小于15 μm²的细胞核（图3C）。
图3 EdU染色肠类器官的定量图像分析结果。（A）采用球形及多边形模式对类器官进行圈选。（B）分析中需排除的区域以白色标记（箭头所示），该区域为类器官腔体，内含部分死细胞，后续分析中将予以剔除。（C）分析后的图像显示所有分割后的细胞核：Hoechst33342阳性核标记为蓝色，EdU阳性核标记为黄色，未达到15 µm2的细胞核分别用绿色（Hoechst33342）和橙色（EdU）标注。比例尺=50微米。
最终定量分析EdU+信号占总DNA量的百分比（图4）。研究发现，顶端向外类器官的增殖水平显著低于基底向外类器官。
图4 类器官增殖速率分析。以EdU阳性DNA占总DNA的百分比作为类器官增殖速率的表征指标，结果显示基底向外类器官的增殖活性显著高于顶端向外类器官。
实验步骤
类器官培养
1. 将成人干细胞来源的肠类器官包埋于基底膜提取物（BME）中，接种于24孔板，使用玻璃移液管进行机械传代。
注：在本实验方案中，使用了Geltrex作为BME。
2. 小心吸除包埋类器官的优化培养基。
3. 每孔加入500 µL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，吸吹将所有基质圆顶从孔中分离。将类器官转移至15 mL离心管，充分重悬以彻底解离水凝胶基质。
4. 将类器官与0.05%胰蛋白酶-EDTA于37℃水浴中孵育，直至完全解离为单细胞或小细胞团。
5. 用基础培养基稀释胰蛋白酶/细胞悬液，基础培养基体积至少为胰酶的2倍。
6. 420 g、8℃离心5分钟，尽量去除上清。
7. 将细胞重新包埋于BME中，接种至与步骤1相同数量的孔板，并补充优化培养基。
8. 于细胞培养箱中孵育3天，随后进行步骤2的操作。
极性反转诱导与EdU标记
1. 小心吸除BME包埋类器官中的培养基。
2. 每孔加入500 µL的类器官收获溶液，并通过反复吸吹将所有基质圆顶从孔中分离。将类器官转移到15 mL离心管中，并充分重悬以完全分离水凝胶基质。
3. 将15 mL离心管置于冰上孵育1.5小时。每隔10分钟充分摇晃试管，以防止类器官聚集并确保剩余水凝胶成分均匀分离。
4. 孵育期间，用抗粘附溶液包被96孔板。按24孔板每孔对应8孔96孔板的比例进行包被，室温孵育至少1小时。
5. 向15 mL管中加入至少两倍于类器官收获溶液体积的PBS，并在8℃下以150 g离心5分钟。
6. 移除上清液，将类器官重悬于1 mL的PBS中。
7. 将500 µL的类器官/PBS悬浮液转移到另一个15 mL离心管中，并再次8℃下以150 g离心5分钟。
8. 弃去96孔板中的抗粘附溶液。
9. 离心后，尽可能移除上清液。
10. 使用一个试管用于生成悬浮培养的基底向外（BO）类器官，另一个试管用于顶端向外（AO）类器官。
11. 对于BO类器官，在一个试管中，向96孔板的每个孔中加入100 µL含有7.5% BME的精制培养基。充分混合，并将类器官均匀分散到预包被的96孔板的所需孔数中。
12. 对于AO类器官，在另一个试管中，向96孔板的每个孔中加入100 µL不含BME的普通精制培养基。充分混合，并将类器官均匀分散到预包被的96孔板的所需孔数中。
13. 在37°C和5% CO₂下孵育类器官3天。
注：形态学差异将在第1天后开始显现。然而，先前发表的结果表明，大约需要3天时间，大多数类器官才能呈现出顶端外极性。
14. 在诱导极性反转后的特定时间点，向所有待标记的类器官孔中加入50 µL稀释在精制培养基中的3 µM EdU，使每个孔的最终浓度达到1 µM EdU。
15. 在37°C和5% CO₂下孵育1.5小时。
16. 使用宽口径吸头收集EdU标记的类器官，并将其转移到15 mL离心管中。
17. 向每个试管（BO和AO类器官）中加入等量的4% PFA（最终浓度为2% PFA），并小心混合。
18. 在室温下孵育15分钟。
19. 向15 mL管中加入至少两倍于管内体积的PBS，并在8℃下以150 g离心5分钟。
20. 移除上清液，将类器官重悬于1 mL的PBS中。
21. 再次在8℃下以150 g离心5分钟。
22. 移除上清液，将类器官重悬于1 mL的PBS中，并将其转移到1.5 mL离心管中。将类器官保存在4℃，直至进行EdU染色反应
23. 重复步骤14-22，以分析每个时间点。
Click-it EdU染色反应和Hoechst 33342染色
1. 在4℃下，以50 g离心固定后的类器官5分钟。
2. 移除上清液，使用宽口径吸头将类器官重悬于1 mL的3%牛血清白蛋白（BSA）溶液中（用PBS稀释）。
3. 重复步骤1和2。
4. 移除上清液，将类器官重悬于1 mL的0.5% Triton X-100溶液中（用PBS稀释）。
5. 在室温下孵育20分钟。
6. 在室温下以50 g离心类器官5分钟。
7. 在一个新的试管中，通过混合45 µL的水和5 µL的10x Buffer Additive来准备1x Buffer Additive。
8. 在另一个试管中，通过混合以下成分来准备反应混合液：385.8 µL的水、43 µL的10x反应缓冲液、20 µL的CuSO₄、1.2 µL的Alexa Fluor 647叠氮化物和50 µL的1x Buffer Additive。
注：这种混合液足够进行五次染色反应，可根据需要的染色反应数量进行调整。
9. 重复步骤1和2两次洗涤。
10. 移除上清液，向每个含有类器官的试管中加入100 µL的反应混合液（来自步骤8）。
11. 在室温下在黑暗中孵育30分钟。
12. 重复步骤1和2洗涤。
13. 在室温下以50 g离心类器官5分钟。
14. 将类器官重悬于1 mL的10 µg/mL Hoechst 33342溶液中（用PBS稀释）。
15. 在室温下在黑暗中孵育45分钟。
16. 重复步骤1和2洗涤。
17. 在4℃下以50 g离心类器官5分钟。
18. 将类器官种植在适合共聚焦显微镜成像的基底膜提取物（BME）基质中。
19. 在共聚焦显微镜下对类器官进行成像。
半自动图像分析
1. 将共聚焦显微镜图像导入图像分析软件，并定义一个文件夹用于保存分析文件。使用“将图像作为时间点”选项导入多张图像（包括重复图像、不同时间点、不同处理等）。每张图像将被视为一个单独的时间点，便于在各个图像之间切换。
2. 打开分析面板，并导入作为补充文件1提供的分析流程（arivis_EdU_pipeline）。
3. 使用“放置新对象”工具和标记为“Organoid”的“球体”工具，轻松圈出所有分离良好的类器官。
4. 切换到下一张图像，即下一个时间点，并继续标记所有图像中的类器官。
5. 对于彼此非常靠近、无法使用“球体”模式分离的类器官，打开对象列表并激活“Organoid”标记。
6. 继续使用“绘制对象”工具的“多边形”模式手动标记类器官轮廓。
注：在对象列表中，所有类器官现在都已标记并分配到特定的时间点。这些时间点对应于步骤1中导入的图像顺序。如果需要，可以将这些时间点重命名为与原始图像名称一致。
7. 在对象列表中，标记所有对象（=类器官），右键单击，然后点击“移除标记”，以移除所有对象的“手动”标记。
8. 在对象列表中停用“Organoid”标记，并使用“绘制对象”工具的“多边形”模式标记所有应从分析中排除的区域。这些区域可能包括类器官腔内的死亡细胞或模糊区域，这些区域可能会干扰分析。
9. 打开对象列表时，确保所有类器官都标记为“Organoid”，所有应排除的区域都标记为“手动”。
10. 点击左上角的箭头启动分析流程。
注：软件现在将分割Hoechst33342和EdU通道中的所有细胞核。此分析流程仅考虑大于15 µm²的分割后的Hoechst33342+和EdU+细胞核（即细胞核区域的面积），以确保排除可能来源于死亡细胞的小细胞核。
11. 通过点击“特征列”标签，在对象列表中查看分析结果。
12. 切换到“主从视图”，在上部面板中选择“类器官”标记和“第一时间点”特征。
13. 在下部面板中，选择要显示的每个类器官的特征。使用投影（x/y/z）面积（体素）、平均强度#1（EdU通道）和标准差强度#1。
14. 使用Excel导出功能导出结果（主从报告）。
15. 保存分析文件并关闭软件。
类器官增殖率的测定
1. 打开导出的“主从报告”文件。
2. 每个分析的图像都有一个单独的标签页。
计算每个图像中细胞核和EdU染色的面积/体素总和。
然后，将所有结果数据复制到一个新的汇总标签页中，并将所有属于同一时间点的数据分组。
3. 然后，计算每个图像中细胞核的总面积（即Hoechst33342+面积和EdU+面积的总和）。
4. 接下来，将总面积除以自身（=100%），并将平均EdU+面积除以总面积（=EdU+DNA的百分比）。
5. 在y轴上绘制BO和AO类器官的增殖性DNA的百分比，在X轴上绘制不同的时间点。
小结
本研究成功建立了顶端向外肠道类器官的培养方法，并通过EdU标记和半自动图像分析技术评估了其细胞增殖率。研究结果表明，顶端向外类器官的细胞增殖率显著低于基底向外类器官，这可能是由于极性反转后细胞死亡率增加所致。
尽管顶端向外类器官在细胞增殖方面存在局限性，但它们为研究细胞顶端表面的功能提供了新的工具，特别是在代谢研究和感染性疾病研究中具有重要应用前景。
基础培养基与优化培养基配方
参考文献
Csukovich G, Wagner M, Schmidhofer K, Pratscher B, Burgener IA. Generation of Apical-Out Intestinal Organoids and Assessment of Organoid Proliferation Rate Using EdU-Labeling. J Vis Exp. 2025 Mar 28;(217). doi: 10.3791/68039.
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